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Recherche d'un lien de clonalité
 
Le typage des Legionella est réalisé dans un objectif d'investigations des cas de légionellose et d'épidémiologie globale
 
1- Typage systématique des souches de Legionella isolées des patients

Le CNR réalise le typage des souches reçues au CNR ainsi que de celles isolées en culture dans notre laboratoire.

Le typage repose sur l'identification du Sequence Type (ST) des souches qui peut être obtenu par Sequence Based Typing (SBT) ou par Whole Genome Sequencing (WGS) :

  • le SBT (Gaia V. et al. Consensus sequence-based scheme for epidemiological typing of clinical and environmental isolates of Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 2005 May;43(5):2047-52) qui correspond au séquençage de 7 gènes de ménage des Legionella pneumophila : flaA, pilE, asd, mip, mompS, proA et neuA permettant d’établir un ST en fonction des numéros d’allèles retrouvés.
  • le WGS : les 7 gènes d'intérêt sont extraits du génome complet

Les principaux ST retrouvés en France, ainsi que leur évolution dans le temps sont présentés dans la figure ci-dessous :

 ST 2019.png

 Figure. Evolution de la distribution des 9 principaux STs associés à l’infection en France de 2015 à 2019.

 

2- Investigation des cas de légionelloses - Comparaison de souches

Toute demande de comparaison doit être faite par l'ARS (cf. infos pratiques pour télécharger les fiches d'envoi)

Lors des enquêtes épidémiologiques, les souches sont analysées selon 2 méthodes :

- L’AP-PCR (arbitrary-primed PCR, adaptée de F. Grattard et al. JCM 1996 ) est une technique de screening peu discriminante, qui permet d’obtenir un profil de migration de l’ADN génomique des souches Legionella pneumophila. Si les souches présentent un profil commun, un typage par WGS est réalisé.

- Le Whole Genome Sequencing est un séquençage du génome complet de la souche. Cette technique permet différentes analyses :

  • L’analyse du ST basée sur 7 gènes est l’analyse la moins discriminante. Néanmoins, il peut permettre de différencier des souches pour des clones non endémiques.
  • L’analyse de cgMLST (core genome MLST) repose sur l’analyse de 50 gènes (définis au niveau européen) ou de plus de 1450 gènes de Legionella pneumophila (cgMLST ad hoc). Une base de données commune européenne est en cours de développement.
  • L’analyse phylogénétique à partir de mapping sur un génome de référence ou d'assemblage de novo (construction d'un arbre phylogénétique et/ou analyse du nombre de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)) est l’analyse la plus discriminante. Elle est réalisée pour discriminer les grands clones de L. pneumophila (ST1, ST23,…) dans un contexte épidémique.

 

Méthode appliquée sur prélèvement : Nested-SBT

La technique de SBT peut être appliquée directement sur prélèvement clinique en s'affranchissant de l'isolement de souches. Cette méthode a été développée par le CNR. Le protocole est maintenant disponible sur le site de l’HPA (Health Public Agency).

Ginevra C, Lopez M, Forey F, Reyrolle M, Meugnier H, Vandenesch F, Etienne J, Jarraud S, Molmeret M. J Clin Microbiol. 2009;47:981-7.

Cette méthode doit être privilégiée secondairement à la mise en culture du prélèvement et après échec de celle-ci. Les prélèvements pulmonaires peuvent être adressés au CNR pour la réalisation de cette analyse.